Рекомбинант вакцины үйлдвэрлэлийн технологи, вакцины омгийн молекул биологийн судалгаа
Салбар : Хөдөө аж ахуйн (ХАА) шинжлэх ухаан
Төслийн дугаар : 022
Төслийн төрөл : ШУТ төсөл
Хугацаа: 2011-2013
Санхүүжилт: 60000.00 мян.төг
Түлхүүр үг : рекомбинант вакцин, вакцины омог, вакцины технологи, генетикийн судалгаа, Вакцины шинэ үеийн хүчлүүр
Үр дүн
1. Сонгины Био үйлдвэрт 2005 онд шөвөг ярын вакцины омгийг ВТ-Bovine test болон үхрийн хээлийн бөөр, арьсны өсгөвөрт халдаахад халдвар хийснээс хойш 5-7 хоногт эс эмгэгшиж байв. Эс эмгэгшүүлж буй вируст материалыг тухайн эсэд нь 3-4 удаа дамжуулан халдаахад эс эмгэгшүүлэх хугацаа 2-3 хоногоор багасаж, эсийн эмгэгшил ихэсч байв. Эс эмгэгшүүлж буй 7 дээжийг ПГУ-аар стандарт праймер (F-5’ gct cta aag atg geg tg -3’, R-5’ gta cte etg get gaa gag cg 3’) ашиглан шинжлэхэд 408 (bp)-д тод ванд (тунадасжилт) өгч байв. Өөрөөр хэлбэл вирусийг MDBK, BHK, RK-13 эсүүдэд дасган вакцины загвар бэлтгэж эсийн өсгөвөрт вакцины загварыг 20 мян/тун үйлдвэрлэж, Төв аймгийн Лүн суманд 5000 ишиг, Баянцагаан суманд 5000 тун, Ховд аймгийн Чандманьд 5000 мян/тун, Хэнтий аймгийн Дэлгэрхаанд 5000 мян/тун бүгд 20000 ишгэнд туршин сорилоо. Хамгаалах идэвхи сайтай байгаад үндэслэн бэлдмэлийн холбогдох техникийн баримт бичгийг боловсруулав.
2. Судалгааны ажлын хүрээнд өдгөө мал эмнэлгийн вакцин үйлдвэрлэлд өргөн ашиглаж байгаа хүчлүүрүүдийг шалгах технологи боловсруулах, малын биед харьцангуй урвалж чанар багатай, мал, амьтны дархлааны хариу урвалыг дэмжиж, дархлааны үргэлжлэх хугацааг уртасгах нөлөө бүхий шинэ үеийн хүчлүүрийг хайж илрүүлэх, шинээр үйлдвэрлэх аргачлалын загвар боловсруулах зорилго тавин ажиллалаа. Энэхүү зорилгын хүрээнд уурагт материалууд болох өндөгний шар, элэгний эд, тархины эдээс лецитин бэлтгэн туршлаа. Туршилтаар лецитиний агууламж хамгийн өндөртэй өндөгний шарыг цаашдын туршилтанд түүхий эд болгон ашиглав. Цусан халдварт өвчний үүсгэгч Pasteurella multocida болох нь нотлогдсон омгийг вакцин бэлтгэх эсрэгтөрөгч болон шалгуур эсрэг төрөгчөөр өндөгний шараас бэлтгэсэн липосомыг үүсгэгч бүхий цийдмэгээр 1/5, 1/10-аар шингэлээд нэгэн жигд болтол сайн холиод (вортекс) вакцины загвар гарган авлаа. Вакцины загварыг туршлагын цагаан хулганад туршихад өндөгний шарын уургаас бэлтгэсэн лецитинийг ашиглан хийсэн липосом бүхий цусан халдвартыын үүсгэгчтэй вакцины загвар нь хоруу омгоор хийсэн зориудын халдвараас 33.3% буюу Биокомбинат ТӨУҮГ-т үйлдвэрлэсэн үхрийг цусан халдвараас сэргийлэх вакцинтай ижил үр дүн үзүүлж байгаа нь эсрэгтөрөгчийн депо үүсгэх шинж чанар бүхий липосомын технологийг ашиглан вакцины хамгаалах идэвхийг сайжруулах, тарих тун, хэмжээг бууруулах боломж байгаа нь харагдаж байна.Энэхүү судалгааны ажлыг цаашид үргэлжүүлэн хийж липосомтой вакциын хадгаах хугацаа, дархлааны үргэлжлэх хугацаа болон хамгаалах хугацаа зэргийг нарийвчлан тогтоож, улмаар үйлдвэрлэлд нэвтрүүлэх боломжийг судлан тогтоох шаардлагатай.
3. Сэдэвт ажлын хүрээнд бэлчээрийн хачгаар дамжин халдварладаг манай ард түмний дунд “Хачгийн халуун” гэж нэршсэн бабезиоз нь Babesia сүүлийн жилүүдэд ихэнх аймагт тухайлбал тал хээрийн болон говийн аймгуудад жил дараалан адууны бабезиоз гарч байгаа нь уг өвчинд анхаарал хандуулах шаардлагатай байгааг харуулж байна. Рекомбинант технологи нь аюулгүй, цэвэршилт сайтай, идэвхи өндөр зэрэг давуу талтай тул вакцины технологид нэвтрүүлбэл үр дүнтэй байх бүрэн боломжтой юм. Адууны хачгийн халуун өвчнийг үүсгэгч B. caballi, Т. equi –ийн халдвараас урьдчилан сэргийлэх өвөрмөц вакцины загварыг бий болгох зорилгоор дээрх 2 үүсгэгчийн өвөрмөц рекомбинант уургуудын хамгаалах идэвхийг туршин сорисон. Бидний цэвэршүүлэн авсан рекомбинант ЕМА-2t/GST уургийн гарц 2000мг/мл, B. caballi-гийн RAP1 /GST уургийн гарц 1000мг/мл байв. Т. equi, B. caballi-ийн хоруу чанар өндөртэй нутгийн өсгөвөрүүдийг 5% CO2, 5% O2 олон хийн оролт бүхий дулаан баригчид 37°C-ийн дулаанд чийгшилт бүхий дулаанд өсгөвөрлөхөд амжилттай өсгөвөржиж байв. Рекомбинант ЕМА-2t/GST, RAP1 /GST уургууд нь дархлаа төрүүлэх идэвхи өндөр байна. Харин рекомбинант ЕМА-2t/GST, RAP1 /GST вакцины зорилгоор туршихад аюулгүй боловч хамгаалах идэвхи хангалттай сайн биш байлаа.
4. Сэдэвт ажлын хүрээнд бид үхрийн неоспороз болон токмоплазмозын оношлогоонд 2 рекомбинант NcSAG1/GST уураг нь 62 кДа (36+26 кДа) молекул жинтэй, TgSAG2/GST уураг нь 48кДа (22+26 кДа) молекул жинтэй уургийг цэвэршүүлж оноүлжжр болгон ашиглалаа. NcSAG1/GST болон TgSAG2/GST мөн GST уургуудийг 5, 10мкг/мл- ээр тооцоолон хийж ФХЭБУ-ын оношлогоонд ашиглахад рекомбинант NcSAG1/GST нь мэдрэг болон өвөрмөц чанар өндөртэй байв. Рекомбинант TgSAG2/GST-г 5 мкг/мл болон 10 мкг/мл- ээр тооцоолон хийж ФХЭБУ-г тавихад 1:800 ийлдсийн шингэлэлтэнд эерэг болон сөрөг ийлдсийн гэрлийн шингээлт өвөрмөц байв. Харин 5мкг/мл –ээр тооцон шингэлсэн рекомбинант TgSAG2/GST нь оношлогооны мэдрэг чанар өндөртэй байлаа. Бид цэвэршүүлсэн рекомбинант антигенаар үхрийн неоспорозыг оношлох зорилгоор 779 дээжийг ФХЭБУ-аар шинжлэхэд 11.5% халдвартай байна. Мөн үхрийн токсоплазмозын халдвар 8.5% халдвартай байна.
5. Сэдэвт ажлын хүрээнд Бабезиа болон Анаплазмын халдварыг хонь, ямаанд түрхэцийн болон молекул биологийн аргуудаар оношлох арга шинээр боловсруулан оношийг баталгаажуулах зорилгоор Баян-Өлгий, Дорноговь, Дундговь, Өмнөговь, Төв, Сэлэнгэ, Булган, Архангай, Сүхбаатар, Хэнтий, Дорнод аймгийн нутгаас хонь, ямааны 700 цусны дээж цуглуулан ПГУ-аар шинжилгээ хийсэн. Анаплазма илрүүлэх ПГУ-н шинжилгээгээр 450 дээжийн 354(78.6%) нь, Бабезиа илрүүлэх ПГУ-н шинжилгээгээр 700 дээжийн 8(1.1%) нь тус тус эерэг байлаа. Манай орны хонь, ямаан сүрэгт Anaplasma, Babesia төрлийн үүсгэгчийн халдвар байгаа нь түрхэцийн шинжилгээгээр илэрсэн ба ПГУ-ын шинжилгээгээр батлагдсан бөгөөд цаашид халдварлалт, тархалтыг нарийвчлан судлах шаардлагатай.
6. Бэлчээрийн хачгаар дамждаг өвчний талаарх судалгаа, түүний дотор бог малын бабезиоз, анаплазмоз өвчний дамжуулагч болж байгалийн голомтыг нөхцөлдүүлж байгаа бэлчээрийн хачгийн төрөл зүйл огт судлагдаагүй тул энэхүү судалгаанд 2013 оны 4 сараас 5-р сард нийт 9 аймгийн 31 сумдын нутгаас цуглуулсан 931 хачгийн дээжийг судалгаандаа ашиглалаа. Цуглуулсан нийт хачгийн зүйлийг Н. А. Золотаревын аргаар гэрэлтүүлэгч бүхий 10 дахин өсгөлттэй лүүпээр харж мөн хүйсийг тодорхойлоход нийт 6 зүйлийн хачиг илэрсэн. Бэлчээрийн хачгийн нийт дээжнээс газар нутгийг төлөөлүүлэн эр эм нийлсэн 480 хачгийн ДНХ-г нийтлэг хэрэглэгддэг фенол/ хлороформын аргаар ялгасан. Дээрх хачгуудаас ялгасан ДНХ-д Babesia болон Theileria төрлийг илрүүлэх ПГУ тавьхад Dermacentor nuttalli хачгийн 2 дээж эерэг дүн үзүүлсэн. Энэхүү 2 ПГУ-ын бүтээгдэхүүнд NdeI энзимээр ПГУ-ТХУП (PCR-restriction fragment length polymorphism) туршиж үзэхэд Babesia ovis зүйлийн ДНХ олшроогүй нь тогтоогдсон. Цааш нь Babesia ovis, Babesia crassa болон Babesia motasi илрүүлэх үүрэн ПГУ тавьсан. Дээрх эерэг 2 дээж нь Babesia motasi-ийг илрүүлэх праймераар явуулсан ПГУ-д 170 хос суурь орчимд өвөрмөц тод толбо үзүүлсэн. Түүнчлэн A. ovis, A. marginale илрүүлэх ПГУ тавьж үзэхэд D. nuttalli-ийн 1 дээж эерэг дүн үзүүлсэн. Иймд дан A. ovis илрүүлэх ПГУ тавьхад эерэг дүн үзүүлсэнгүй. Иймээс A. marginale зүйлээр эерэг болох нь тодорхойлогдлоо. Бидний хийсэн судалгааны дүнгээс харахад B.motasi болон A. marginale цусны паразитуудыг D. nuttalli зүйлийн хачиг дамжуулж байна.
7. Сэдэвт ажлын хүрээнд Монгол орон бол хөдөө аж ахуй тэр дундаас мал аж ахуй эрчимтэй хөгжиж буй орон юм. ДХХ бол малын тоо толгойн өсөлтөд ихээхэн нөлөөлдөг хавтлын бус халдварт өвчин бөгөөд хонь болон ямааг тэр дундаа ихэвчлэн төл малыг хавар намрын цагт ихээр өвчлүүлдэг юм. Бидний энэхүү судалгаанд ДХХ өвчиний эсрэг вакцины омгыг молекул биологийн түвшинд шалгаж үзэх зорилгоор ДХХ - ын С болон Д хэвшлийг тодорхойлох өвөрмөц праймеруудыг ашиглаж ПГУ явуулсан. Үр дүнд бид МЭЭСБУЛ - д хадгалагдаж байгаа ДХХ- ын эсрэг вакцин үйлдвэрлэхэд ашиглагдаж байгаа хоёр омгуудын нэг нь С хэвшлийн үүсгэгчийн хорыг ялгаруулах ген агуулж байгааг тогтоосон хэдий ч Д хэвшлийн хорны ген агуулаагүй байгааг илрүүлэв.
8. Манай оронд СТИ омгоор 1935 оноос, stern омгоор 1972 оноош хойш вакцины үйлдвэрлэлд хэрэглэгдэж байгаа байгаа 2004 онд мөн омгийг шинээр олон улсын халдвартын товчооноос авсан бөгөөд сүүлийн жилүүдэд вакцины чанарын талаар орон нутгийн малын эмч нарын зүгээс гомдол гарч байгаатай холбогдуулан вакцины чанар түүнд агуулагдах эсрэгтөрөгчийн чанарыг шалгах зайлшгүй шаардлага гарч байгаа билээ.
B. anthracis нь pag (протектив антиген, PA), lef (леталь фактор, LF), cya (хавангийн фактор, EF) гэсэн хоруу чанарыг нөхцөлдүүлэгч генүүдийг агуулсан pXO1, поли-γ-D-глутамины хүчил (полиглютамат) капсулын ген зэрэг таван генийн иж бүрдэл агуулсан pXO2 гэсэн хоёр плазмидийг агуулдаг бөгөөд вакцины омогт pXO2 плазмид байдаггүй учир капсул нийлэгжүүлдэггүй. Иймээс вакцинд агуулагдаж байгаа үүсгэгчийн плазмидын бүрдэлийг болон уургийн бүрдэл дотроос дархлаа төрүүлэгч үндсэн уураг болох PA уураг вакцинд байгаа эсэх, идэвхитэй дархлаа үүсгэх чадавхитай эсэхийг шалгах зайлшгүй шаардлагын үүднээс уг судалгааг хийв. Вакцины шат бүрээс бэлтгэсэн дээжийн ДНХ-ийн дээжүүдэд pXO1 плазмидийг агуулж, харин pXO2 плазмидыг агуулаагүй байна. Штерн омгоос бэлтгэдэг вакцин нь дархлаа үүсгэгч антигенийг агуулж байгаа нь вакцин хамгаалах идэвхтэйг харуулж байна. Мөн үйлдвэрийн технологийн горим зөв явагдаж, үйлдвэрлэлийн шатанд вакцин аюулгүй байгааг илтгэж байна.
9. Манай оронд бог малын сохор догол өвчнийг үүсгэж буй эмгэг төрүүлэгчийн төрөл, зүйлийг молекул биологийн орчин үеийн дэвшилтэд арга зүйгээр баталгаажуулах зорилготойгоор дараах зорилтыг дэвшүүлсэн. Бог малын сохор догол өвчний эмнэл зүйн шинж тэмдэгтэй малаас илрүүлсэн өсгөвөр, вакцины үйлдвэрлэлд ашиглаж буй өсгөвөр зэргийг нян судлал, ПГУ-аар төрөл зүйлийг баталгаажуулах. Нян судлал, ПГУ-аар баталгаажуулсан өсгөвөрийн ДНХ-ын дарааллыг хэсэгчилсэн дараалал (partial secquence) тогтоох аргаар шалгасан. Бидний илрүүлсэн Микоплазм төст өсгөвөрүүд болон бог малын сохор догол өвчнөөс сэргийлэх вакцины үйлдвэрлэлд ашиглаж буй өсгөвөрүүд нь M.agalactiae зүйл болох нь ПГУ–аар батлагдаж байна. Нутгийн бог малаас өсгөвөрлөн авсан M. agalactiea-ийн өсгөвөрт ДНХ-ийн дараалалыг тогтоох шууд Sequencе (partial sequence) хийж лавлагаа омогуудтай харьцуулахад М. agalactiea PG2 (accession number CU179680 ) омогтой ойролцоо дараалалтай байхад М. agalactiea 5632 (accession number FP671138 ) омог болон бусад зүйлийн Mycoplasma spp - аас ялгаатай байгаа нь харагдаж байна.
10. Манай оронд мал, амьтны боомын эсрэг Stern омгийн хоруу чанарыг сулруулсан, спор хэлбэрт амьд вакциныг ашигладаг бөгөөд энэхүү вакцин нь дархлаа төрүүлэх чадвар сайтай боловч дэлхий нийтээр амьд вакцинаас татгалзаж буй өнөөгийн нөхцөлд дархлаа төрүүлэх идэвх сайтай шинэ үеийн вакцины судалгааг эхлүүлэх шаардлагатай байна. Энэхүү судалгааны ажлын хүрээнд B. anthracis-ийн хоруу чанарыг нөхцөлдүүлэгч хамгаалагч эсрэгтөрөгч РА болон спорын гадаргуугийн уураг болох EA1 уургуудыг рекомбинантаар гарган авч тэдгээрийн боомын үүсгэгчийн эсрэг хамгаалах идэвхийг хулганад туршиж вакцины загвар гаргах оролдлого хийлээ. Судалгааны үр дүнд дараах дүгнэлтүүд гарлаа. rPA болон rEA1-ийг манай орны нөхцөлд цэвэршүүлэн авах боломжтой байна. Рекомбинант уургуудийн эсрэг эсрэгбиемүүд нь дангаараа хамгаалах идэвх 80 хувьтай байхад дээрх 2 уургийн хоршсон хэлбэр нь хулганад хийсэн туршилтаар хамгаалах идэвх 100 хувьтай байгааг харуулж байна. Бидний гарган авсан 2 уургуудийн дархлаа төрүүлэх идэвх болон хамгаалах идэвх үзүүлж байгаа тул цаашид гарган авах вакцины хувилбарт ашиглаж болох юм. Хамгаалах идэвхийн туршилтыг том амьтанд туршиж үзэхийн өмнө дархлаа төрүүлэх идэвхийг нарийвчлан судлах шаардлагатай байна.