TALEN-ын аргаар GRK5 генийн нокаут хулгана гарган авах
Салбар : Байгалийн шинжлэх ухаан
Улсын дугаар : 3831
Хамгаалсан он : 2014
Түлхүүр үг : c57bl/6 хулгана, нуклеаза энзимд суурилсан арга, генотип өөрчлөлт, удамшил
Аннотаци
Серин/треониний бүлгийн киназа болох G уурагтай хамааралт рецепторуудын киназа (GRK) нь G уурагтай хамааралт рецепторуудыг (GPCRs) фосфоржуулах үндсэн үүрэгтэй.
G уурагтай хамааралт рецепторуудын киназа (GRK) –ын бүлгийн уургуудыг гурван дэд бүлэгт GRK1 (GRK1 ба 7), GRK2 (GRK2 ба 3), GRK4 (GRK4, 5, 6) хуваадаг. GRK5 нь идэвхжсэн GPCR-ыг фосфоржуулснаар рецепторын дохио дамжилтыг зогсоодог бөгөөд мРНХ нь тархи, зүрх, уушиг, эхэс зэрэг эдүүдэд ихээр илэрдэг.
Эсийн загвар системд GRK5 нь GPCR-ийн бүлгийн ß2-adrenergic, M2-muscarinic, secretin, angiotensin AT1, and thyroid stimulatin¬g hormone receptor зэрэг хэд хэдэн рецепторуудыг фосфоржуулж байгаа нь тогтоогдсон.
Мөн GRK5 генийн дараалал нь GPCR-ийн идэвхижилтэнд чухал үүрэгтэй секвенсийн хэсгийг агуулж байдаг.
Сүүлийн үеийн хэд хэдэн судалгаагаар GRK5-ийн үйл ажиллагааны алдагдал нь эрт үеийн Алцхеймерийн өвчинтэй холбоотой байж магадгүй гэсэн таамаглалууд дэвшүүлсэн байна.
Transcription like effector nucleases (TALENs) нь сонгомолоор ДНХ-ийн гинжийг таньж холбогддог бөгөөд FokI endonucleases нь өвөрмөц бусаар ДНХ-ийн гинжийг тасалдаг. Энэхүү судалгаанд бид эдгээр энзимүүдийн нийлбэр системийг хулганы GRK5 генийн дараалалд нокаут хийхэд ашигласан.
Бид хулганы GRK5 генийн 1, 3, 5 дугаар экзоныг таньж таслах боломжтой TALEN векторуудыг боловсруулж, 293T эсэд тэдгээрийн үйл ажиллагааг шалгасан.
Үр дүнг цитометрээр хэмжихэд 1, 3, 5 дугаар экзонд үйлчилсэн TALEN системийн идэвхижил тус бүр
8.7%,
9.7%,
12.7% байв. Эндээс 5 дугаар экзоны векторууд (зүүн, баруун)-ыг mMessage mMachine T7 Ultra kit ашиглан транскрипцид оруулж мРНХ болгон хувиргасан. Ийнхүү боловсруулж, цэвэршүүлсэн поли (A) мРНХ-ийн концентрациуд нь 1327 нг / мкл, 1458 нг / мкл байв. Эдгээр мРНХ-ээс 4 нг/ мкл-ийг нь 180 нэг эст хөврөлийн цитоплазмд микро тарилга хийсэн. 24 цагийн турш өсгөвөрлөсний дараа амьд үлдсэн хоёр эст хөврөлийг 7 C57BL / 6 тээгч хулганад шилжүүлэн суулгасан.
Эндээс төрсөн 53 зулзганы генотипийг T7E1 болон секвенсийн аргаар шалгахад 3 зулзага (
5.6%) генотип өөрчлөлтөнд орсныг илрүүлсэн. Тухайлбал, #39 дугаартай зулзаганд GRK5 генийн 3 нуклеотид, # 28-д 45 нуклеотид, #41-д нь 2 нуклеотид тус тус делеци болсон. GRK5 генийн мутант болох 3 Fo –ыг үржилд оруулж F1 зулзгануудад генотипийн өөрчлөлт тогтвортой удамшиж байгааг тогтоосон. Бид #28, # 41 дугаартай мутантуудын гомозигот 10 хулганыг F3 ба F2 үеүд дээр гарган авч T7E1 болон секвинсийн шинжилгээгээр баталсан. Мөн C57 BL хулганы эдүүдэд GRK5 генийн экпрэссийг шалгасан. RT-ПГУ-ын үр дүнгээс харахад GRK5-ын мРНХ нь уушиг болон тархинд ихээр илэрч байгааг харуулж байна. Харин элэг, бөөр, зүрхэнд GRK5 мРНХ-ийн экпрэсс бага байв. Нортерн блоттингийн шинжилгээнд зүрх, уушиг, тархи, бөөрний нийт РНХ-ийг ялгаж хэрэглэсэн бөгөөд үр дүнд GRK5-ын мРНХ нь ~ 3kb орчимд тархи, уушигны эдэд их хэмжээтэйгээр, зүрхний эдээс дунд зэрэг хэмжээтэй илэрчээ. Тархины эдийн иммуногистохимийн шинжилгээгээр GRK5 уураг нь cerebellum-ийн molecular layer (Ml) эсүүдэд, hippocampus (Ca)-ийн campus болон subicu¬lum (Sb) эсүүдэд байрлаж байгааг илрүүлсэн.
Энэхүү судалгаагаар GRK5 генийн нокаут гомозигот хулганын хоёр шугам (# 28, # 41) үүсгэсэн. Мөн TALEN-ийн аргаар гарган авсан генотип өөрчлөлт нь дараагийн үедээ тогтвортой дамжиж байгааг илрүүлж баталсан.
Зохиогч
Боловсролын доктор(PhD)
Бүтээлийн тоо : 1
Ишлэгдсэн тоо : 0
